La cola poli-A es una cadena de nucleótidos de adenina añadida al extremo 3' del ARN mensajero después de la transcripción. Esta modificación hace que el ARNm sea más estable y lo protege frente a la degradación.
La cola poli-A desempeña un papel esencial en la expresión génica de procariotas y eucariotas. Convierte el transcrito primario de ARNm en ARNm maduro y, por tanto, resulta importante para que pueda producirse la traducción.
Qué es la cola poli-A
La cola poli-A es una cadena de adeninas formada mediante poliadenilación por la enzima poli-A polimerasa. Esta estructura ayuda a exportar, mantener y proteger el ARNm maduro.
El ARNm es uno de los distintos tipos de moléculas de ARN. Sus unidades básicas son los nucleótidos A, U, G y C. El ARN mensajero contiene la información necesaria para formar una proteína. Los otros dos tipos principales de ARN son el ARN de transferencia, o ARNt, y el ARN ribosómico, o ARNr, que también participan en este proceso.
Después de completarse la transcripción, varias proteínas y enzimas ayudan al ARNm a prepararse para la traducción. Estructuralmente, el ARNm maduro que contiene la cola poli-A no es muy diferente del pre-ARNm: es una cadena monocatenaria de nucleótidos, más corta que un gen, con una caperuza 5' y una cola poli-A 3'.
| Elemento | Ubicación | Función principal |
|---|---|---|
| Caperuza 5' | Extremo 5' | Minimiza la degradación y facilita la traducción |
| Regiones no traducidas | A ambos lados del marco de lectura | Participan en la regulación y estabilidad del ARNm |
| Marco de lectura abierto | Región codificante | Contiene la secuencia que determina la proteína |
| Cola poli-A | Extremo 3' | Favorece la estabilidad, la exportación y la traducción |
La cola poli-A dentro de la expresión génica
Los genes producen proteínas mediante un proceso de tres etapas conocido colectivamente como dogma central: replicación, transcripción y traducción.
La replicación, gobernada por la ADN polimerasa, forma copias de un gen, de genes completos o del ADN. La ARN polimerasa forma el ARNm funcional mediante la transcripción y, finalmente, mediante la traducción del ARNm se produce una proteína.
No todas estas etapas tienen lugar en el núcleo. La replicación y la transcripción ocurren en el núcleo, mientras que la traducción se produce en el citoplasma celular.
El proceso conocido como procesamiento del ARN es esencial para proteger el ARNm. El ARNm transcrito se conoce como transcrito y contiene información para codificar una proteína. El ARNm sin procesar, conocido como pre-ARNm, no puede formar correctamente una proteína o produce una proteína anómala.
Por este motivo, son necesarias modificaciones del ARNm, como la adición de una caperuza 5' y de una cola poli-A en el extremo 3'.
Por qué el pre-ARNm necesita procesamiento
En teoría, el ARNm contiene únicamente la región codificante, una vez eliminados los intrones, y puede traducirse en una proteína después de exportarse al citoplasma. Sin embargo, el ARNm maduro debe afrontar varios problemas durante este proceso.
Las enzimas del citoplasma pueden degradarlo y generar una proteína truncada, anómala o incompleta, o impedir incluso que se forme cualquier proteína. El procesamiento del ARN protege al ARNm maduro en ambos extremos mediante distintas modificaciones, y la cola poli-A es una de las modificaciones que evita su degradación rápida.
La caperuza y la cola poli-A se añaden al ARN mediante métodos enzimáticos; es decir, no están codificadas directamente en el molde de ADN a partir del cual se obtienen las copias de ARN.
Cómo se forma la cola poli-A
El proceso mediante el cual se forma la cola poli-A se conoce como poliadenilación o adenilación. Está gobernado por la enzima poli-A polimerasa, que añade nucleótidos de adenina al extremo terminal del ARNm.
La poliadenilación postranscripcional comienza cuando entran en acción distintas proteínas, enzimas y elementos de secuencia. Varias proteínas, como CPSF, SctF, PAP, PABII, CFI y CFII, participan en la actividad catalítica.
La proteína CPSF corta el extremo 3' para que pueda producirse la adenilación. Estas actividades comienzan en el extremo de la transcripción, cuando se forma el ARNm o, más precisamente, el pre-ARNm.
Después interviene la poli-A polimerasa, que inicia el proceso de poliadenilación. Las secuencias PAS, o señales de poliadenilación, entre ellas AAUAAA y las secuencias ricas en GU del ARNm, regulan la formación de la cadena de adenosinas.
La polimerasa añade entre 100 y 250 adeninas, en forma de monofosfato de adenosina, al extremo 3' y elimina el pirofosfato.
La poliadenilación también ocurre en los microARN.
Longitud de la cola poli-A
El intervalo habitual de adición de la cola poli-A es de 100 a 150 adenosinas. Sin embargo, los estudios muestran que genes de distinta longitud pueden presentar colas poli-A de longitudes variables: algunas son muy cortas y otras son largas.
La longitud de la cola también varía entre organismos. Los seres humanos y otros eucariotas relacionados tienen colas poli-A más largas, de aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, mientras que las levaduras presentan colas comparativamente más cortas, de hasta 33 adenosinas.
| Organismo o contexto | Longitud indicada |
|---|---|
| Seres humanos y eucariotas relacionados | 100 a 150 nucleótidos |
| Levaduras | Hasta 33 adenosinas |
| Rango de adición descrito para la poli-A polimerasa | 100 a 250 adenosinas |
La longitud de la cola poli-A puede influir en la estabilidad y la traducción, pero su efecto depende del organismo, del tipo de transcrito, de las proteínas asociadas y del contexto experimental.
Algunos estudios han mostrado que las colas más largas proporcionan mayor estabilidad y eficiencia de traducción. Un estudio informó de un aumento de la estabilidad y de la eficiencia con colas poli-A de 120 adenosinas frente a colas de 51 adenosinas. Otro estudio describió una superioridad funcional del ARNm con una cola poli-A de 325 adenosinas frente a una de 172 adenosinas.
Sin embargo, otros estudios han indicado que una cola poli-A más larga puede asociarse con una traducción menos eficiente de transcritos de baja abundancia, mientras que una cola más corta puede permitir una traducción correcta y una regulación más estrecha de la expresión génica.
Estos resultados aparentemente diferentes se explican porque la longitud de la cola no es el único factor que determina el comportamiento del ARNm. También influyen las proteínas que protegen la cola, la secuencia del transcrito, el tipo celular y el organismo.
Por tanto, no existe una regla universal según la cual una cola más larga sea siempre mejor. En general, una cola más larga ofrece mayor protección frente a la degradación, pero la eficiencia de traducción y la regulación de la expresión dependen de condiciones adicionales.
Protección de la cola poli-A
Durante el transporte del núcleo al citoplasma, proteínas como PABPC y PABPN se unen a la cola poli-A y la protegen.
Aunque la función exacta de cada una de estas proteínas no está completamente clara, las adenosinas no protegidas se eliminan más rápidamente de la cola que las adenosinas protegidas.
Ni la longitud de la cola poli-A ni la longitud del gen determinan por sí solas la velocidad de la desadenilación. El papel de otras proteínas que protegen la cola determina la velocidad de desadenilación y, por consiguiente, la longitud de la cola.
Además, los procesos de guanilación y uridilación también regulan la longitud de la cola poli-A.
Funciones de la cola poli-A
Estabilidad del ARNm
Las moléculas de ARNm son inherentemente inestables y propensas a la degradación. La cola poli-A aumenta su estabilidad al actuar como un amortiguador que protege la molécula frente a la degradación.
La longitud de la cola poli-A influye en la estabilidad del ARNm: cuanto más larga es la cola, más tiempo puede tardar en producirse la desadenilación completa.
Las nucleasas presentes en el citoplasma pueden cortar el ARNm, especialmente mediante exonucleasas. La cola poli-A actúa como sitio de unión para numerosas proteínas que evitan el corte del ARNm.
Exportación del núcleo al citoplasma
La cola poli-A y las proteínas que se unen a ella acompañan al ARNm durante su transporte hacia el citoplasma.
El procesamiento correcto del ARNm permite que el transcrito maduro sea reconocido, protegido y transportado de forma adecuada desde el núcleo hasta el citoplasma.
Traducción
La cola poli-A promueve la traducción al reclutar proteínas de traducción, incluidos los factores de iniciación eucariotas 4G y 4E.
Las interacciones entre la cola poli-A y estas proteínas de traducción, junto con la caperuza 5', producen una estructura de «bucle cerrado» que favorece la traducción del ARNm.
La cola poli-A no participa directamente en la traducción, pero puede ayudar a unir algunas proteínas implicadas en ella, como el factor iniciador G.
También facilita sitios de unión para numerosas proteínas, factores y enzimas necesarios para que se produzca la traducción.
Regulación de la expresión génica
La función principal de las modificaciones postranscripcionales es promover y regular la expresión génica.
Cuando un gen produce una proteína mediante transcripción y traducción, se considera que está expresado. El gen se activa y produce proteínas cuando estas son necesarias.
Por ello, es fundamental que la célula regule la cantidad de proteína que se forma en un tejido o célula determinados.
Al proteger el ARNm maduro frente a la degradación y favorecer su traducción, la cola poli-A influye directamente en la cantidad de proteína que puede producirse.
Desadenilación y degradación del ARNm
Al igual que la adenilación, la desadenilación es importante para el procesamiento y la degradación del ARNm.
La desadenilación ocurre en el citoplasma, donde una exonucleasa específica comienza a acortar la cola poli-A. Otras enzimas, como las PNPasas, también pueden participar en este proceso.
Una vez que la cola poli-A se elimina mediante desadenilación, el ARNm puede degradarse por acción de una exonucleasa que actúa en dirección 3' a 5'.
La desadenilación no debe interpretarse únicamente como un proceso perjudicial. También constituye un mecanismo de regulación de la vida media del ARNm y, por tanto, de la expresión génica.
Diferencias entre eucariotas y procariotas
La explicación de la cola poli-A y de su procesamiento suele centrarse en el ARNm de mamíferos y otros eucariotas. Las bacterias y otros procariotas pueden presentar mecanismos diferentes.
En los eucariotas, la cola poli-A suele actuar como una estructura protectora que favorece la estabilidad del ARNm.
En los procariotas, la poliadenilación puede favorecer la degradación del ARNm y contribuir a la regulación de la expresión génica. Por ejemplo, en Escherichia coli, la adición de una cola poli-A induce la degradación del ARNm en lugar de estabilizarlo.
Por tanto, la afirmación de que una cola poli-A estabiliza el ARNm se aplica principalmente al contexto eucariota y no debe generalizarse a todos los organismos.
Cola poli-A en ARNm terapéutico
El potencial terapéutico del ARN mensajero permite abordar enfermedades que antes se consideraban difíciles o imposibles de tratar mediante otros métodos.
Las moléculas de ARNm utilizadas en distintas terapias, como vacunas frente a agentes infecciosos y tratamientos contra el cáncer, contienen una caperuza CAP en el extremo 5'. Esta estructura minimiza la degradación y facilita la traducción al unirse a los ribosomas de la célula.
El extremo 3' también está protegido, en este caso por una cola de adeninas o cola poli-A, que consta habitualmente de entre 100 y 150 nucleótidos de adenina y evita la degradación de la molécula por parte de las ribonucleasas.
El uso terapéutico del ARNm ofrece un enfoque novedoso para objetivos terapéuticos considerados anteriormente inaccesibles. Como parte de un ecosistema más amplio de moléculas de ARN terapéutico, los ARNm se han vuelto cada vez más frecuentes, especialmente después de su utilización en el desarrollo de vacunas contra la COVID-19.
Además, presentan ventajas inherentes derivadas de su naturaleza no integrativa y transitoria.
Los ARNm terapéuticos pueden emplearse en varias modalidades de tratamiento. Como vacuna, los ARNm que codifican antígenos pueden administrarse para inducir una respuesta inmunitaria protectora.
Con independencia de la aplicación, los ARNm terapéuticos comparten componentes estructurales o composicionales similares. Cada molécula contiene un marco de lectura abierto monocatenario, u ORF, que incluye la secuencia de interés, el principal elemento diferenciador relacionado con la finalidad terapéutica.
El ORF está flanqueado a ambos lados por regiones no traducidas, o UTR. En la parte frontal de la molécula se encuentra la caperuza 5', que interviene en la traducción del ARNm.
La cola poli-A impulsa la eficacia terapéutica de la molécula de ARNm. Su diseño e integridad pueden influir considerablemente en la eficacia final del tratamiento.
Longitud de la cola en terapias de ARNm
En general, las colas poli-A más largas proporcionan mayor estabilidad y eficiencia de traducción. Un estudio describió una mayor estabilidad y eficiencia con colas de 120 adenosinas en comparación con colas de 51 adenosinas.
Otro estudio comunicó una superioridad funcional del ARNm con una cola poli-A de 325 adenosinas frente a una de 172 adenosinas.
No obstante, el diseño óptimo depende de la molécula terapéutica, del sistema de producción y de las condiciones en las que se evalúa el ARNm.
Modificaciones químicas y estructurales
La introducción de modificaciones químicas específicas en la cola poli-A también puede aumentar la eficiencia de traducción.
Los cambios en la estructura de la cola poli-A han demostrado ser útiles para mejorar la eficacia del ARNm terapéutico.
Algunas investigaciones han mostrado que la introducción de segmentos de entre 40 y 60 nucleótidos, que contienen al menos dos adenosinas separadas por un elemento espaciador de longitud diferente, aumenta la eficiencia de traducción en comparación con una secuencia poli-A nativa.
Por qué es necesario medir la cola poli-A en medicamentos de ARNm
La poliadenilación enzimática genera colas poli-A de tamaños muy variables, lo cual influye notablemente en la eficiencia de la traducción que producirá la proteína deseada.
Los ARNm con colas muy cortas se degradan rápidamente y no llegan a traducirse en una proteína.
Por este motivo, es necesario desarrollar técnicas analíticas que permitan conocer la longitud de la cola poli-A del ARN terapéutico.
La Farmacopea de los Estados Unidos y otras instituciones reconocen la importancia de verificar la longitud y la integridad de la cola poli-A en los tratamientos basados en ARNm.
La evaluación de la longitud y la estabilidad de la cola poli-A constituye una medida crítica de control de calidad para los ARNm terapéuticos.
Métodos para detectar y medir la cola poli-A
Transcripción inversa y amplificación específica
El método de amplificación mediante transcripción inversa mediada por guanosina e inosina, conocido como método G/I, permite detectar eficazmente la cola poli-A del ARNm.
En el primer paso, una polimerasa específica de la cola poli-A añade residuos de guanosina e inosina a la cola poli-A del ARNm.
Después, mediante la transcriptasa inversa, el ARNm que contiene la cola poli-A y los residuos GI se convierte en ADN complementario, o ADNc.
Para detectar el producto formado se utilizan dos conjuntos de cebadores de amplificación. Un conjunto amplifica el gen de estudio en una región situada antes de la cola poli-A, mientras que el segundo conjunto, con un cebador inverso universal, amplifica la región que contiene la cola poli-A.
La electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis PAGE permite separar y detectar los productos de amplificación.
Además, el ensayo de PCR cuantitativa puede cuantificar la cola poli-A y el ARNm.
Cromatografía líquida y espectrometría de masas
El análisis de mezclas complejas, como las vacunas, requiere métodos instrumentales que primero separen la mezcla en sus componentes y después permitan identificarlos y cuantificarlos.
Una de las técnicas más potentes disponibles actualmente es la cromatografía acoplada a espectrometría de masas.
La determinación de la longitud de la cola poli-A se realiza rompiendo las moléculas de ARN con la ribonucleasa T1, que degrada la cadena en todas las posiciones que contienen el nucleótido guanina.
La columna cromatográfica separa los distintos fragmentos según su tamaño. Entre ellos se encuentran las colas poli-A, que también se separan según el número de nucleótidos que contienen.
Los fragmentos más largos tienen tiempos de retención más cortos porque interaccionan menos con la fase estacionaria de la columna. Los fragmentos pequeños interaccionan más y presentan un tiempo de retención mayor, por lo que tardan más en salir de la columna.
La Farmacopea de los Estados Unidos recomienda actualmente utilizar cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con par iónico, o IP-RP-HPLC, para evaluar la presencia y la longitud de la cola poli-A.
Este método resulta adecuado para secuencias pequeñas, pero presenta dificultades con secuencias de ARN más largas. La estabilidad de estas secuencias largas dentro de la columna constituye un desafío adicional.
PCR digital en gotas
La PCR digital en gotas, o ddPCR, tiene numerosas aplicaciones en el desarrollo de tratamientos basados en ARNm.
Entre sus ventajas se encuentran la cuantificación absoluta sin necesidad de una curva estándar, una elevada tolerancia a los inhibidores de la PCR y una sensibilidad y especificidad muy altas.
Se ha demostrado que la ddPCR permite detectar de forma robusta el contenido de cola poli-A en fracciones de proteína de la espícula del SARS-CoV-2.
Estos resultados respaldaron las observaciones iniciales realizadas mediante IP-RP-HPLC y mostraron que la tecnología ddPCR puede medir con precisión el grado de presencia de la cola poli-A en distintas fracciones del ARNm.
Análisis del transcrito y expresión génica
El transcrito es el ARNm maduro a partir del cual se formará una proteína. Un ARNm anómalo no puede producir correctamente una proteína.
Para comprender la naturaleza del procesamiento del ARN y de la cola poli-A, resulta útil cuantificar la expresión génica.
Si se conoce cuánto ARNm se expresa, puede determinarse la actividad de la poliadenilación y de la desadenilación.
La PCR cuantitativa con transcripción inversa, o qRT-PCR, y los microarrays son dos técnicas que permiten cuantificar los distintos ARNm presentes en una muestra.
La PCR cuantitativa con transcripción inversa convierte primero el ARNm en ADNc y después lo cuantifica.
El microarray mide la expresión génica mediante hibridación con sondas.
Qué otros controles requiere un ARNm terapéutico
Los problemas analíticos no terminan con la evaluación de la cola poli-A. También es necesario comprobar que la mayor parte de las moléculas poseen la caperuza, determinar el grado de degradación del ARN, identificar las moléculas rotas, medir el tamaño de las nanopartículas lipídicas y controlar la presencia de posibles impurezas.
La pandemia de COVID-19 situó al ARNm en el centro de los nuevos enfoques terapéuticos, y esta tecnología ha entrado en una etapa principal de desarrollo y comercialización para múltiples indicaciones.
La cola poli-A es fundamental para la capacidad de traducción, la estabilidad y, en último término, el beneficio terapéutico del ARNm. Como ocurre con otros medicamentos, disponer de un conjunto sólido de métodos analíticos es esencial para garantizar la integridad y el éxito del producto de ARNm.